Биосинтез каротиноидов

Исследования биосинтеза каротиноидов установили наличие универсального пути у высших растений, водорослей, бактерий и грибов через общие предшественники всех терпеноидных соединений — мевалоновую кислоту и изопентенилпирофосфат.

Грибы
Грибы как объект исследования биосинтеза каротиноидов

Биосинтез каротиноидов можно разделить на несколько этпаов. Первым из них является образование мевалоновой кислоты из ацетил-кофермента А (рис. 1). Последовательность реакций, ведущих от ацетил-КоА к мевалоновой кислоте, хорошо изучена на животных организмах (как отмечалось ранее, животные сами не могут синтезировать каротиноиды, однако они синтезируют мевалоновую кислоту, которая используется как предшественник в синтезе других соединений, в частности стеролов). До настоящего времени не исследовались ферменты растений, включенные в синтез ‘beta;-окси-‘beta;-метил-глютарил-КоА (ОМГ-КоА): ацетоацетил-КоА-тиолаза и ОМГ-КоА-синтаза. Однако имеются сообщения, что хлоропласты высших растений , а также хромопласты зрелых плодов перца однолетнего содержат фермент ОМГ-КоА-редуктазу, который способен превращать ОМГ-КоА в мевалоновую кислоту.

Интересные исследования провели K.Grumbach и B.Forn . Они инкубировали функционально активные пластиды шпината с несколькими субстратами: CO2, уксусной, пировиноградной, фосфоенолпировиноградной, 3-фосфоглицериновой и мевалоновой кислотами. Все они поглощались пластидами и все, за исключением фосфоенолнировилоградной кислоты, включались в ‘beta;-каротин.

Хотя точный путь образования ацетил-КоА из фотосинтетически фиксированного углекислого газа не выяснен, анализ кинетики включения субстратов показал, что ацетил-КоА образуется непосредственно из промежуточных продуктов редуктивного пентозофосфатного цикла (из фосфоглицериновой и пировиноградной кислот) как предшественников, а затем используется либо для синтеза жирных кислот либо для образования мевалоновой кислоты.

Биосинтез каротиноидов

Рисунок 1 — Образование мевалоновой кислоты из ацетил-КоА.

Такие исследования не проводились на изолированных хромопластах. Однако следует отметить, что хромопласты цветков нарцисса желтого, способные синтезировать каротиноиды из изопентенилпирофосфата , содержат все ферменты, необходимые для превращения углекислого газа, уксусной кислоты, 3-фосфоглицерина и т.д. в ацилированные липиды . Эти результаты вместе с данными о том, что изолированные хромопласты перца однолетнего способны превращать ОМГ-КоА в мевалоновую кислоту, позволяют заключить, что на первом этапе синтеза каротиноидов происходит образование мевалоновой кислоты из ацетил-КоА, как показано на рис. 1.

Образование изопентенилпирофосфат

Рисунок 2 — Образование изопентенилпирофосфата из мёвалоновой кислоты.

Однако следует принимать во внимание и возможность поступления и хромопласты мевалоновой кислоты, синтезированной в цитоплазме клеток. Показано, что в процессе трансформации хлоропластов перца однолетнего в хромопласты мембраны оболочек пластид приобретают способность пропускать это вещество.

Способность постепенно возрастает, достигая максимума при соотношении каротиноидов и хлорофилла, равного 1,66, после чего наблюдалось некоторое снижение проницаемости мембран мевалоновой кислотой. Но даже в полностью сформированных хромопластах она сохранялась на довольно высоком уровне.

Следующий этап в синтезе каротиноидов — превращение мевалоновой кислоты в изопентенилпирофосфат (рис. 2).

В первой реакции участвует фермент мевалонаткяназа. Превращение мевалонил-5-фосфата в мевалонил-5-пирофосфат осуществлялось в присутствии мевалонил-5-фосфокиназы. Наличие указанных ферментов и катализируемых ими реакций отмечалось для многих растений и микроорга низмов . Они были продемонстрированы и в опытах с изолированными хромопластами перца однолетнего. Мевалонат-5-пирофосфоангидраза, которая участвует в реакциях образования изопентенилпирофосфата, была очищена из дрожжей и латекса гевеи. В то же время сам изопентенилпирофосфат был обнаружен во всех исследованных объектах. Более того, было показано, что он превращается в каротиноиды в препаратах хлоропластов и хромопластов растений.

На этапе превращения изопентенилпирофосфата в геранилгеранилпиро фосфат с последующим образованием фитоина происходит изомеризация изопентенилпирофосфата (ИПФ) до диметилаллилпирофосфата (ДМАПФ), после чего следуют пренилтраноферазные реакции, ведущие через геранил- и фарнезилпирофосфаты до геранилгеранилпирофосфата.

Доказательства присутствия изопентенилпирофосфат-изомеразы (ИПФ изомеразы) в хромопластах получены при изучении пластид томатов, а в плодах тыквы было обнаружено два изофермента ИПФ-изомеразы . В литературе отсутствуют сведения о включении ДМАПФ в каротиноиды, однако ингибирование превращения мевалоновой кислоты в каротиноиды иодацетамидом свидетельствует, что ДМАПФ является промежуточным продуктом в синтезе каротиноидов.

Образование фитонина

Рисунок 3 — Образование фитоина из изопентенилпирофосфата.

Способность геранилпирофосфата превращаться в каротиноиды была продемонстрирована на препаратах многих высших растений, в том числе на пластидах корнеплодов моркови и плодов томатов. Свободный гераниол также включался в ‘beta;-каротин высечками из корнеплодов моркови, по-видимому, в результате присутствия ферментов, способных фос форилировать гераниол. Было также показано, что пластидные системы корнеплодов моркови и плодов томатов способны включать фарнезил-пирофосфат в ‘beta;-каротин.

В дальнейшем происходит объединение двух молекул геранилгеранил-пирофосфата (ГГПФ) с образованием префитоинпирофосфата, дефосфорилирование которого ведет к образованию первого С40-каротиноида (рис. 3).

Эксперименты по включению изолированными хромопластами перца однолетнего радиоактивного изопентенилпирофосфата показали, что первым синтезированным С40-соединением является фитоин. Сходные результаты получены и при изучении хромопластов желтого нарцисса. В изолированных хромопластах перца однолетнего фитоин представлен в виде транс-(0,2 %) и цис-(99,1 %) изомеров.

Более того, опыты, выполненные с плодами перца однолетнего in vivo, показали, что заметное количество меченой мевалоновой кислоты включается только в цис-фитоин. Эти данные ясно показывают, что цис-фитоин — первый каротиноид, синтезируемый в хромопластах. В хромопластах, как и в тканях высших растений в целом, первым С40-соединением является цис-изомер, хотя известно, что в некоторых микроорганизмах первым синтезированным каротиноидом является транс-изомер фитоина.

Из ацетоновых порошков пластид томатов был выделен белковый комплекс, способный превращать изопентенилпирофосфат в фитоин. Этот комплекс очищался фракционированием сульфата аммония и на колонке с биогелем А без потери составляющих активностей (ИПФ-изомеразы, пренилтраисферазы, фитоинсинтетазы). Его молекулярная масса 166 000 или 200 000 . Комплекс активен в присутствии ионов марганца и его активность в 6-7 раз увеличивалась в присутствии АТФ. Функция АТ-5 в стимулировании активности не ясна, поскольку АТФ не включается непосредственно в реакции, происходящие при превращении изопентенилпирофосфата в фитоин. Возможно, АТФ принимает участие в стабилизации комплекса или действует как аллостерический регулятор ферментной активности.

Фитоин-синтетазный комплекс

Фитоин-синтетазный комплекс очень нестабилен. При обычных ионных методах очистки белков на ДЭАЭ-целлюлозе он полностью терял способность синтезировать фитоин, хотя при этом сохранялась ИПФ-изомеразная и пренилтрансферазная активности. Более того, в процессе фракционирования на ДЭАЭ-целлюлозе происходила диссоциация комплекса на несколько компонентов.

 

При очистке ИПФ-изомеразы из ацетоновых порошков пластид томатов в 245 раз использовали многоэтапный способ с последовательным фракционированием сульфатом аммония, гель-фильтрацией на биогеле А 1.5 М, ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-фильтрацией на сефадексе Г-100 и хроматофокусированием. Очищенный фермент был стабилен несколько недель в 0,1 М калий-фосфатном буфере, рН 7,0, со держащем 2 мМ дитиотреитола. По свойствам ИПФ-изомераза пластид плодов томатов сходна с ИПФ-изомеразами из других источников (дрожжи, печень свиньи, плоды тыквы).

Фермент очень чувствителен к присутствию иодацетамида (полностью инактивируется последним в концентрации 1 мМ). Вместе с тем ИПФ-изомераза пластид томатов ингибируется промежуточными продуктами синтеза каротиноидов диметилаллил- и геранилпирофосфатами, в то время как фарнезилпирофосфат не оказывал существенного влияния на активность этого фермента.

Молекулярная масса ИПФ-изомеразы пластид плодов томатов 34 000 Д. Это значительно ниже аналогичного значения для фермента печени свиньи (82 500 Д). Характерна ли небольшая молекулярная масса для сходных ферментов других растений — неизвестно, так как до настоящего времени не было сообщений о характеристике ИПФ-изомераз из других растительных объектов.

 

Единственным кофактором, необходимым для функционирования фермента, были ионы двухвалентных металлов (Mn2+ или Mg2+), причем в вариантах опыта, в которых одновременно присутствовали оба элемента, отмечалась максимальная активность ИПФ-изомеразы.

Ионы двухвалентных металлов также необходимы для активации пренилтрансферазы. Однако последняя лишь незначительно ингибировалась иодацетамидом в концентрации 10 мМ, тогда как для полного ингибирования ИИФ-изомеразы достаточно в 10 раз меньше этого реагента. Следует отметить, что пренилтрансферазы из других источников менее чувствительны, чем ИПФ-изомеразы и к сульфгидрильным реагентам.

Молекулярная масса пренилтрансферазы пластид плодов томатов (дашгые хроматографии на сефадексе Г-100) 64 000 Д, что несколько ниже, чем соответствующее значение для аналогичных ферментов из дрожжей, печени свиньи, гороха.

Пренилтрансфераза пластид плодов томатов катализировала следующие реакции конденсации: изопентенилпирофосфат + диметилаллилпиро-фосфат, изопентенилпирофосфат + фарнезилпирофосфат, изопентенилпирофосфат + геранилпирофосфат. Эти три активности элюировались с колонки как один пик. Хроматографический анализ продуктов, полученных в результате реакций, катализируемых пренилтрансферазной фракцией, показал, что один из новообразованных компонентов ведет себя как префитоиновый спирт.

Это предполагает, что фермент, который катализирует образование префитоинфосфата, также представлен в пренилтрансферазной фракции. Однако такой вывод пока что не может быть однозначным, поскольку электрофоретический анализ пренилтрансферазной фракции в присутствии додецилсульфата натрия обнаружил значительную гетерогенность препарата. Достоверные данные могут быть получены лишь при работе с абсолютно чистым ферментом.

Фитоин-синтетазный комплекс имеет молекулярную массу 166 000 или 200 000 Д. ИПФ-изомераза и пренилтрансфераза вместе составляют приблизительно 100 000 Д. Остается фракция 66 000 — 100 000 Д. Вероятно, она отвечает за образование фитоина.

Фитоин — бесцветное соединение. Его превращение в окрашенные каротиноиды сопровождается увеличением размера сопряженного полиенового хромофора посредством серии реакций десатурации в каждой из которых удаляется по два атома водорода и вводится двойная связь. В опытах, выполненных на хромо-, хлоропластах и тканях высших растений, установлено, что промежуточными соединениями в цепи реакций десатурации являются фитофлуин, J-каротин, нейроспорин и конечный продукт ликопин.

Реакции десатурации легко ингибируются многими соединениями, включающими пиридазиноновые гербициды SAN 6706 и 9789, способствующими накапливанию фитоина.

Поскольку ново-синтезированный фитоин представлен цис-изомером, а все окрашенные каротиноиды имеют транс-конфигурацию, в процессе десатурации фитоина должна происходить изомеризация. Эксперименты, выполненные на хромопластах плодов перца однолетнего и томатов, а также на других источниках, свидетельствуют, что превращение цис-изомера в транс-изомер происходит на уровне фитофлуина.

В частности, хромопласты перца однолетнего и томатов содержали фитофлуин в цис— и в транс-конформации, в то время как все последующие соединения в цепи превращения фитоина посредством реакций десатурации представлены транс-изомерами, а транс-фитоин представлен только в следовых количествах (рис. 14).

Таким образом, в процессе превращения фитоина в ликопин происходят четыре этапа десатурации с одновременным введением двойной связи и однократная изомеризация цис-изомера в транс-форму.

Превращение каротиноидов в хромопластах

Рисунок 4 — Схема превращений каротинов в хромопластах.

G.Britton предполагает существование ферментного комплекса, составляющего интегральную часть мембранной структуры, принимающего участие в реакциях десатурации. Из ацетоновых порошков пластид томатов была выделена и частично очищена с помощью фракционирования сульфатом аммония ферментная система, способная осуществлять превращение фитоина в ликопин. Однако вопрос о составных компонентах этой системы еще не выяснен, имеются лишь предположения о существовании одной изомеразы, превращающей цис-изомер каротиноида в транс-форму.

В мандариновой разновидности томатов вместо транс-каротинов накапливаются поли-цис-каротиноиды, такие, как проликопин и др. Цис-изомеры фитофлуина, f-каротина и нейроспорина были идентифицированы как вероятные промежуточные соединения в синтезе проликопина. В то же время нормальные красные плоды и плоды мутантных растений с мандариновой окраской различаются между собой лишь по одному гену.

Очевидно, что дефектный ген в мандариновой разновидности томатов кодирует изомеразу, которая недостаточно эффективно осуществляет изомеризацию цис-фитофлуина в транс-изомер. При этих условиях происходит десатурация циc-изомеров с образованием поли цис-каротиноидов. Это должно предполагать достаточно широкую специ фичность десатураз, участвующих в превращении каротинов, поскольку они с высокой эффективностью вводят двойные связи не только в транс-, но и в цис-изомеры.

В настоящее время не совсем ясно количество десатураз, участвующих в реакциях десатурации каротиноидов. Было показано, что превращение фитоина в фитофлуин зависит от НАДФ, тогда как реакции, ведущие от фитофлуина до ликопина, требуют ФАД и Мn2+. По-видимому, существуют по крайней мере две десатуразы, участвующие в дегидрогенировании каротинов, причем в превращении фитоина в фитофлуин участвует отдельный фермент.

Изолированные хромопласты перца однолетнего способствуют превра щению фитоина в ликопин без добавления НАДФ. На первый взгляд это противоречит ранее полученным результатам об участии НАДФ в реакциях десатурации каротинов. Однако было показано, что в интактных хромопластах содержатся достаточно высокие количества эндогенного НАДФ (910 пикомоль на 1 мг белка), что не исключает возможности участия НАДФ в реакциях десатурации.

Имеются также предположения, что в процессах переноса электронов при десатурации участвуют ионы металлов и цитохромы.

Дальнейшие реакции синтеза каротиноидов связаны с циклизацией концевых групп. Циклические каротиноиды с ‘beta;-и е-кольцами (см. структурные формулы ‘beta;- и е-каротинов) широко распространены в природе, в том числе в фотосинтезирующих органеллах и хромопластах высших растений.

При определении в цепи биохимических превращений точек, в которых происходит циклизация каротиноидов, используют ингибитор гербицидной природы 2-(4-хлорфенилтио) триэтиламмоний хлористый и никотин. Когда пло ды перца однолетнего обрабатывали 2-(4-хлорфенилтио) триэтиламмонием хлористым, накапливался ликопии и в значительно меньшей степени нейроспорин, в то время как (‘beta;-каротин и другие циклические каротиноиды исчезали, хотя этот гербицид не вызывал такого эффекта in vitro.

Сходное действие на биосинтез и накопление каротиноидов in vivo и in vitro оказывает никотин. Для преодоления противоречий, вызванных различными эффектами реагентов in vivo и in vitro, нейроспорин и ликопин, синтезированные микроорганизмом Phycornyces blakesleanus, инкубировали с хромопластами перца однолетнего. При этом оба предшественника трансформировались в )’beta;-каротин, причем ликопин трансформировался предпочтительнее по сравнению с нейроспорином.

Продолжение: Синтез каротиноидов.

 

Получать интересное на почту

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *