Размер и конформация ДНК
libre 3466
Для начала читаем статью Выделение хромопластной ДНК.
В настоящее время установлено, что нативная ДНК пластид, в том числе и хромопластов, представлена в кольцевой форме. Кольцевые молекулы хромопластной ДНК первыми выделил H.Falk с соавт., который в качестве объекта исследований использовал хромопласты цветков желтого нарцисса.
В полученных препаратах основная масса ДНК была представлена линейными молекулами до 44,5 мкм длины и несколькими сверхскрученными кольцевыми молекулами. Среднее значение длины 8 сверхскрученных молекул хромопластной ДНК составило 42,6 ± 1,2 мкм.
Незначительные расхождения указывали на отсутствие заметной гетеродисперсности в индивидуальных молекулах хромопластных ДНК.
Принимая во внимание поправку на сверхскрученность, равную 3,7 %, авторы заключили, что контурная длина кольцевых молекул ДНК хромопластов желтого нарцисса составляет 44 мкм, что соответствует размеру самых длинных линейных молекул, обнаруженных в исследуемых препаратах ДНК. Молекулярная масса кольцевых молекул составляла 92-106 Д.
В исследуемых препаратах преобладали линейные ДНК, среди которых удалось обнаружить несколько кольцевых молекул. Однако в отличие от ДНК хромопластов венца нарцисса желтого кольцевая ДНК пластид лепестков тюльпана имела открытую конфигурацию.
Для определения контурной длины авторы измерили 6 таких молекул. Отдельные значения составляли 42,4, 42,5, 43,1, 44,1, 44,1, 45,3. На основании этих данных была рассчитана масса кольцевых молекул хромопластной ДНК тюльпана, которая составила 91,6-106 Д и не отличалась от аналогичного значения для ДНК хромопластов желтого нарцисса.
Кольцевые молекулы ДНК выделялись из хромопластов настурции большой. В выделенных препаратах 48 % ДНК было обнаружено в виде линейных молекул и 52 % в виде открытых или сверхскрученных колец. Контурная длина кольцевых молекул ДНК в препаратах хромопластов настурции была несколько больше, чем в пластидах лепестков тюльпана и нарцисса желтого. Их молекулярная масса составила 99,35 кД.
Сравнительный анализ ДНК хромо-, амило- и хлоропластов методом тепловой денатурации и кинетики реассоциации
В настоящее время показано, что геном эукариот, в том числе и растений, не постоянен. Под действием различных факторов окружающей среды, а также в специализированных органах его структура может изменяться.
Так, например, цитофотометрическими методами было установлено, что при переходе растений плюща от ювенильной стадии к взрослой содержание ДНК на гаплоидный геном возрастает на 70 %. А в цветоносных почках бузины содержание ДНК на гаплоидный геном было на 40 % выше по сравнению с вегетативными почками.
Данные тепловой денатурации и кинетики реассоциации показали заметное отличие структуры ДНК генеративных почек и ДНК вегетативных почек, Таким образом, в процессе формирования генеративных органов растений происходит дифференциальная амплификация определенных последовательностей ДНК.
Поскольку образование специализированных пластид происходит в результате дифференциации первоначально однородных органелл, особый интерес представляют исследования возможности изменения структуры ДНК пластид, выполняющие различные функции.
Ранее уже отмечалось, что молекулярные массы кольцевых молекул ДНК хромопластов нарцисса желтого, тюльпана и настурции составляют соответственно 92; 91,6 и 99,35 кД. По этому показателю хромопластные ДНК не отличаются от ДНК хлоропластов исследованных высших растений. R.Herrmann проводил сравнение препаратов ДНК, выделенных из хромо-, хлоропластов, ядер и митохондрий нарцисса.
До плавучей плотности ДНК хлоро- и хромопластов (р = 1,697) практически не отличались от ядерной ДНК (р = 1,698) и заметна отличались от митохондриальной ДНК (р = 1,707). Денатурированные нагреванием ДНК хромо- и хлоропластов также не различались между собой (р = 1,711-1,712) и от ядерной ДНК (р = 1,713) и заметно отличались от митохондриальной ДНК (р = 1,722).
Таким образом, ни нативная, ни денатурированная ДНК хромо- и хлоропластов не отличались между собой по плавучей плотности. Когда образцы денатурированной ДНК ренатурировали 4 ч и центрифугировали в градиенте плотности хлористого цезия, между пластидными и ядерной ДНК наблюдалась четкая разница.
Ядерная ДНК слабо реассоциировала при этих условиях и имела плавучею плотность 1,708-1,711, тогда как хромо- и хлоропластная ДНК почти полностью реассоциировали и имели плавучую плотность около 1,700 г/см3.
Не отличались ДНК хлоро- и хромопластов нарцисса желтого также по температуре плавления (Тпл = 86,0 °С) и дисперсии (7 °С), однако по этим показателям они отличались от ядерной ДНК (соответственно 88 и 9°С). 
А25 - поглощение нативной ДНК при 25 °С, Аt - поглощение ДНК при заданной температуре ДНК хромопластов лепестков и хлоропластов листьев настурции большой имели одинаковую плавучую плотность, температуру плавления и состав оснований, рассчитанный на основе Тпл.
Некоторые различия, наблюдаемые в размерах кольцевых молекул ДНК хромо- и хлоропластов настурции большой, были статистически недостоверны. На основании полученных данных сделан вывод об. идентичности хромопластного и хлоропластного геномов.
Несколько позже этот вывод получил дополнительные подтверждения благодаря результатам рестрикционного анализа. Картины распределения фрагментов, полученных после переваривания ДНК хромо- и хлоропластов нарцисса желтого, оказались идентичны.
С целью изучения возможности изменения структуры ДНК пластид В. П. Лобов и И. А. Петров в своих опытах изучали физико-химические характеристики ДНК хромопластов и амилопласты корнеплодов, а также хлоропластов листьев трех сортов моркови. 
А(бесконечность) - поглощение напевной ДНК при 260 нм, А -поглощение денатурированной ДНК при 260 нм, А, - поглощение реассоциирующей ДНК через t мин после начала реассоциации. Цифры у кривых - концентрации ДНК (МКГ/Мл).
На рис. 1 представлены профили плавления ДНК изученных пластид, а также ДНК бактериофага Т2, которая использовалась в работе в качестве стандарта. ДНК хлоро-, хромо- и амилопластов были сходны между собой и несколько отличались от ДНК бактериофага Т2 по профилям плавления.
Различие заключалось в том, что ДНК бактериофага плавилась в узком температурном диапазоне, тогда как ДНК специализированных пластид моркови характеризовалась значительным интервалом плавления. В табл. 1 представлены характеристики, полученные при расчете кривых плавления.
Тпл ДНК бактериофага и пластид не отличались между собой и составляли 83,5-83,9 °С, что соответствует 34,5-35,6% ГЦ-пар в пластоме. Пластидные ДНК не отличались между собой, а отличались от ДИК бактериофага Т2 по удвоенному стандартному отклонению 2'gama;.
Величина 2о характеризует степень внутримолекулярной гетерогенности по ГЦ-составу. Следовательно, наши результаты показали внутрипластомную гетерогенность в ДНК пластид моркови в отличие от ДНК бактериофага Т2, в которой такая гетерогенность отсутствует.
Исследования хлоропластных ДНК высших растений и водорослей также свидетельствуют о наличии в них гетерогенности по ГЦ-составу. В. П. Лобов и И. А. Петров также изучали кинетика реассоциации ДНК пластид моркови и установлена идентичность реассоциации ДНК хлоро-, хромо-и амилопластов.
На рис. 2 представлены кривые кинетики реассоциации ДНК. Линейность точек реассоциации и возможность экстраполяции к единице, а также прямопропорциональная зависимость между тангенсом угла наклона кривых в данной системе координат и концентрацией раствора ДНК указывают на отсутствие высокоповторяющихся последовательностей в ДНК пластид моркови.
Константы скоростей реассоциации пластидных ДНК находились в пределах 41,67-42,54 и несколько отличались от величины константы скорости реассоциации ДНК бактериофага Т2, которая составляла 36,72.
Кинетическая сложность пластидного генома моркови составила 103,5-105,7 * 106 Д при использовании размера генома бактериофага Т2, равного 120-106 Д. Следует отметить, что кинетические сложности хлоропластных ДНК совпадают с размерами пластомов, рассчитанными на основе электронно-микроскопических измерений, а также полученными в результате суммирования длин рестрикционных фрагментов.
Исходя из этого можно заключить, что размер пластома моркови равняется его кинетической сложности и составляет 103,5-105,7-106 Д. Это несколько выше по сравнению с размерами геномов пластид изученных цветковых- растений, которые находятся в пределах 90-100-106 Д.
Однако недавно появилось сообщение, что кольцевая ДНК хлорогшастов ряски спироделы имеет контурную длину 54,1 ±1,8 мкм, что составляет 115-120 * 106 Д. Это на 25 % больше по сравнению с ранее изученными пластидными ДНК цветковых растений.
По-видимому, значение 90-100* 106 Д для размера пластома цветковых растений весьма условно, поскольку изучено сравнительно небольшое количество пластидных ДНК. В настоящее время установлено, что хромопластная ДНК, подобно ДНК хлоро-, лейкопластов, митохондрий и бактерий локализована в электронно-прозрачных участках матрикса в виде фибрилл диаметром до 25-30 А.
Электронно-прозрачные участки встречаются в хромопластах реже, чем в хлоропластах, и обычно расположены в центре органелл. Хотя структура их не отличается от аналогичных участков у лейко- и хлорогшастов, с морфологической точки зрения эти участки у хромопластов более сходны с таковыми в матриксе лейкопластов.
Они не окружены мембранами тилакоидов и не проявляют четкого отграничения от окружающей стромы. Хромопласты в целом содержат меньше ДНК, чем хлоропласты В тоже время, содержание ДНК в хромопластах заметно выше, чем в амилопластах.
Подобно хлоро- и амилопластам содержание ДНК в хромопластах не постоянно, а изменяется в процессе вегетации растении. Это обусловлено изменением количества копий ДНК на одну органеллу. В отличие от ядерного геном пластид растений, в том числе и геном хромопластов, полиплоидный.
Так, в хромопластах корнеплодов моркови содержится 6-24, лепестков нарцисса желтого - 8, лепестков настурции большой - 36 копий ДНК на одну органеллу. Однако такая полиплоидность пластид противоречит генетическим данным, согласно которым пластом хламидомонады подобен диплоидному.
Для объяснения этого явления была высказана гипотеза, согласно которой при гибридизации две копии играют определяющую, а остальные - подчиненную роль, однако экспериментальных данных, подтверждающих эту гипотезу, не получено.
Таблица 1. Тепловая денатурация пластидных ДНК моркови.
| Сорт | Источник ДНК | ТПЛ, °С | 2'sigma;, °С | Содержание ГЦ-пар, % |
| Контроль | Бактериофаг Т2 | 83,6 | 8 | 34,9 |
| Белая зеленоголовая | Хлоропласты | 83,6 | 13,7 | 34,9 |
| Харьковская | Хромопласты | 83,9 | 13,2 | 35,6 |
| Нантская | Хлоропласты | 83,6 | 13,4 | 34,9 |
| Мшак | Хлоропласты | 83,5 | 13,2 | 34,5 |
ДНК хромопластов из различных источников отличаются между собой по физико-химическим свойствам. Так, размер генома хромопластов корнеплодов моркови 103,5-105,7, лепестков нарцисса желтого 92; лепестков тюльпана 91,6, лепестков настурции большой 99,35 кД.
Температуры плавления хромопластных ДНК нарцисса желтого, настурции большой и моркови соответственно 86,0; 82,5; 83,5-83,9 0С. В то же время ДНК хромопластов по физико-химическим характеристикам не отличаются от ДНК других типов пластид.
Так, ДНК хромо-, амило-и хлоропластов трех сортов моркови имели одинаковые профили тепловой денатурации, температуру плавления, кривые реассоциации, размер генома. ДНК хлоропластов листьев и хромопластов лепестков нарцисса желтого характеризовались сходными плавучими плотностями нативной и денатурированных молекул, температурами плавления, скоростью реассоциации и отличались по этим показателям от ДНК ядер и митохондрий.
ДНК хромо- и хлоропластов этого растения не отличались между собой и по картинам распределения рестрикционных фрагментов в агарозных гелях. А ДНК хромопластов цветков настурции большой не отличалась от ДНК хлоропластов листьев указанного растения по температуре плавления и плавучей плотности.
Можно предположить, что хромопластные ДНК обладают и другими признаками, свойственными пластидным, в особенности хлоропластным ДНК. Известно, что хлоропластные ДНК, как и ДНК амило пластов клубней картофеля , не содержат 5-метилцитозина, в то время как ядерная ДНК метилировала по цитозину до уровня 5 %, а митохондриальная ДНК растений - до уровня 2-3 %.
Другой отличительной особенностью пластидных ДНК является наличие в их структуре рибонуклеотидов, ковалентно встроенных в молекулу ДНК. Хлоропластные ДНК гороха и шпината содержали по 18±2 рибонуклеотида, латука - 12±2 рибонуклеотидов.
Известно, что в отличие от ядерной ДНК ДНК хлоропластов высших растений и водорослей не образует прочных комплексов с белками, сходных с хроматином.
