Синтез каротиноидов в хромопластах
libre 4929
Предлагаем Вам прочесть первую часть: Биосинтез каротиноидов. Опыты, выполненные на хромопластах высших растений, как и эксперименты, проведенные на микроорганизмах, а также на фотосинтезирующих тканях и органеллах, позволили заключить, что основным промежуточным продуктом в цепи биосинтетических реакций, на уровне которого происходит циклизация концевых участков, является ликопин.
Дополнительным компонентом, подвергающимся циклизации, служит нейроспорин. Доказательством этого может быть также наличие у некоторых растительных организмов, в частности у кукурузы и у дельта-мутантов томатов, 'alpha;- и 'beta;-зеакаротинов, которые могут синтезироваться из нейроспорина, но не из ликопина, а также способность созревающих при температуре выше 30 °С томатов синтезировать 'beta;-каротин, несмотря на то, что эти томаты не синтезировали ликопин. 
Опыты с меченым ликопином на экстрактах из пластид плодов различных генетических линий томатов показали, что в образовании 'beta;- ионных колец участвуют два различных фермента.
Это заключение основано на том, что ферментная система некоторых линий томатов осуществляет синтез каротиноидов только с 'beta;-ионным кольцом, тогда как ферментная система других линий в одинаковой степени способна синтезировать каротиноиды с 'beta;- ионными кольцами. J.Porter и S.Spurgeon считают, что введение 'beta;-ионных колец в реакциях превращения ликопина в v-каротин, v-каротина в 'beta;-каротин и 'sigma;-каротина в 'alpha;-каротин осуществляется различными ферментами, хотя экспериментальные данные, подтверждающие эту точку зрения, отсутствуют.
Для превращения ликопина в циклические каротиноиды в качестве кофактора необходим ФАД. Как уже отмечалось, большинство каротиноидов, обнаруженных в объектах растительного происхождения, являются ксантофиллами. Они образуются посредством введения кислородсодержащих групп в каротины. Чаще всего кислород в ксантофиллах представлен в окси-, карбонильных и эпокси-группах, которые локализованы в кольцах и вводятся на последних стадиях биосинтеза каротиноидов.
Наиболее распространенными среди ксантофиллов высших растений являются ксантофиллы с оксигруппами в С-3 и С-3" положениях: зеаксантин и лютеин, биосинтез которых изучался наиболее интенсивно. Можно считать доказанным, что лютеин и зеаксантин образуются гидроксилированием 'alpha;- и 'beta;-каротинов соответственно. Оксигруппа вводится из молекулярного кислорода путем смешанной оксидазной реакции.
Каротиноиды, содержащие 5,6-эпокси-группу, также широко распространены в растениях. Они включают пластидные пигменты виола-, нео- и антераксантин. Эпоксидная группа, по-видимому, так же, как и окси-гругша, вводится непосредственно из молекулярного кислорода.
Эпоксиды и сходные с ними пероксиды играют центральную роль в формировании других каротиноидных структур. Были предложены схемы образования алленовых (с кумуллированными двойными связями) концевых групп неоксантина, циклопентановой концевой группы капсантина и капсорубина, а также ретрокаротиноида эшшольцксантина (рис. 1). 
Реакции включения кислорода в каротины (образование ксантофиллов) в системе изолированных хромопластов протекает менее интенсивно по сравнению с образующими каротины. Несмотря на это В.Сатага с сотр. отмечал значительные количества радиоактивности в 'beta;-криптоксантине, который является монооксипроизводным ('beta;-каротина. Капсантин и капсорубин, основные ксантофиллы хромопластов перца однолетнего, метились менее интенсивно по сравнению с 5,6-эпокси-ксантофиллами (антераксантин, виолаксантин).
Было предположено, что возможной причиной слабого включения радиоактивности в ксантофиллы может быть инактивация фенольными соединениями, обильно представленными в плодах перца, или перокисление мембранных липидов, связанное с образованием малонилальдегида, который может взаимодействовать с некоторыми группами ферментов, участвующих в образовании кислородсодержащих каротиноидов.
Однако эксперименты показали, что инактивация фенолоксидаз метабисульфитом, аскорбиновой кислотой, поливинилпирролидоном, смолой не увеличивала биосинтез ксантофиллов. В то же время в изолированных хромопластах содержание малонилальдегида не увеличивалось в течение инкубации. Следует отметить, что низкое включение радиоактивности не препятствует исследованию превращений ксантофиллов.
Это было продемонстрировано на многих объектах, в том числе и на хромопластах перца однолетнего. В первых экспериментах диски перикарда плодов перца однолетнего выдерживали в среде со стереоспецифически меченой 14С-и Н-мевалоновой кислотой. Меченые каротиноиды разделялись и после очистки сравнивали 3Н/14С соотношения синтезированных каротиноидов и фитоина.
В других опытах капсантин, меченый in vivo из 2-[14С]-мевалоновой кислоты, подвергали щелочному гидролизу, в результате чего получался цитраурин. Эти результаты показали, что ксантофиллы синтезируются из фитоина по тому же механизму, что и 'beta;-каротин. В.Сатага с сотрудниками также показал, что в системе изолированных хромопластов перца однолетнего кетокаротиноиды с циклопентановым кольцом (капсантин и капсорубин) синтезируются из антера- и виолаксантина.
Ферменты, катализирующие эти реакции, были активны в широком диапазоне рН (от 7 до 8) и не зависели от присутствия в инкубационной среде НАДФ(Н). В то же время бьло показано, что препараты изолированных хромопластов способны превращать зеаксантин в антера- или виолаксантин. На основании этих результатов образование ксантофиллов в хромопластах перца однолетнего может быть представлено схематически (рис. 2).
Существенным моментом в изучении, синтеза каротиноидов в хромопластах является установление места синтеза этих пигментов внутри органелл. При разрушении изолированных хромопластов осмотическим шоком получали строму и мембранную фракцию. В строме не обнаружены каротиноиды и галактозилтрансферазная активность, что указывало на отсутствие мембран в этой фракции. Фракция, состоящая из мембран оболочки хромопластов и бесхлорофилльных ламелл, содержала основную массу каротиноидов.
Когда стромальную и мембранную фракции раздельно инкубировали с изопентентилпирофосфатом, первая фракция синтезировала фитоин, в то время как вторая не синтезировала каротиноиды из этого предшественника. Аналогичные результаты, полученные при изучении хромопластов желтого нарцисса, свидетельствуют, что синтез фитоина происходит в строме пластид.
Однако реакции десагурации фитоина, которые ведут к образованию окрашенных каротиноидов, происходят в мембранной фракции. 
Таким образом, синтез каротиноидов в хромопластах является компартментализованным процессом и требует кооперативного взаимодействия фитоин-синтетазы (растворимого фермента) и связанных с мембранами ферментов, осуществляющих последующие реакции десатурации, изомеризации, циклизации и введения кислорода в углеводородные остовы каротиноидов.
Эти результаты также подтверждаются данными расщепления интактных мембран хромопластов перца однолетнего с помощью неионного детергента тритона Х-100. В этом случае основная масса включенной радиоактивности связана с фитоином, в то время как процессы десатурации фитоина были заингибированы.
Гипотезы взаимодействия между ферментами
B.Camara и R.Moneger предложили две гипотезы, чтобы объяснить физиологическую основу кооперативного взаимодействия между стромальными и мембранными ферментами, включенными в биосинтез каротиноидов в интактных хромопластах.
Первая концепция заключается в том, что конденсация изопреновых единиц до фитоина может катализироваться стромальным комплексом. Полученный в результате реакций, катализируемых этим комплексом, фитоин может связываться с белковым носителем, способным к переносу на хромопластные мембраны, где происходят дальнейшие биосинтетические реакции, связанные с введением двойных связей, изомеризацией, циклизацией и вставками кислорода, а также сборка окрашенных пигментов в мембранные комплексы.
Эта гипотеза согласуется с данными о наличии фитоин-синтетазного комплекса в препаратах пластид томатов, который способствовал включению изопентенилпирофосфата в фитоин. При этом отдельные ферментные активности (изопентенилпиро-фосфат-изомераза, пренилтрансфераза, фитоинсинтетеза) прочно связаны между собой и не разделяются обычными методами высаливания и гель-фильтрации.
Другая концепция заключается в том, что растворимая фитоин- синтетаза должна иметь некоторые свойства "периферического белка" и может временно связываться при определенных физиологических условиях (когда происходит синтез новых мембран в течение трансформации пластид) с мембранами. Такая "близость" фитоин-синтетазы с мембранами должна обеспечить включение фитоина в различные участки мембран для его дальнейших превращений.
Подтверждением данной гипотезы может служить сходная ситуация, обнаруженная в хлоропластах, где стромальные ферменты могут находиться в строме или быть временно связанными с тилакоидами в зависимости от физиологического состояния. Возможно, что образование мембран в течение трансформации пластид стимулирует синтез фитоина, в результате чего освобождаются каталитические места для взаимодействия с новыми молекулами субстрата.
В этом смысле следует отметить, что пластидные мембраны, липосомы, а также детергенты стимулируют метаболизм изопентенилпирофосфата стромальной фракцией. Представленные выше результаты не исключали возможности непосредственного участия в биосинтезе каротиноидов цитотшазматического компартмента. Были поставлены специальные эксперименты на тканях листьев пшеницы и плодов однолетнего перца.
Протопласты, полученные из этих объектов, разрушали и фракционировали центрифугированием в сахарозном градиенте. Место расположения в градиенте пластидной фракции при анализе разрушенных протопластов зеленого растительного материала (листья пшеницы и незрелые плоды перца) устанавливали по присутствию хлорофилла и рибулозобисфосфаткарбоксилазной активности.
Фракция хромопластов (при анализе препаратов, полученных из ткани зрелых плодов перца однолетнего) определялась по положению в градиенте каротиноидов. В качестве маркера митохондриальной фракций использовали цитохром С-оксидазную, пероксисомной - каталазную активности. Фитоинсинтетазная активность была связана исключительно с пластидами.
Ни митохондриальная, ни пероксисомальная фракции не содержали заметных уровней фитоин-синтетазной активности. На основании полученных результатов B.Camara заключил, что пластиды - единственное место, в котором происходит синтез фитоина из префитоинпирофосфата. Однако до настоящего времени не решен вопрос о месте синтеза изопентенилпирофосфата. К.Kreuz и H.Kleinig исследовали включение некоторых предшественников синтеза каротиноидов препаратами хлоропластов шпината и хромопластов желтого нарцисса.
Высокоочищенные фракции обоих типов пластид не включали мевалоновой кислоты, мевалонил-5-фосфата и мевалонил-5-пирофосфата в каротиноиды. При идентичных условиях эксперимента изопентенилпирофосфат включался в пластидные полипреноиды в больших количествах.
Однако в присутствии цитоплазматического супернатанта отмечалось включение меченых мевалоновой кислоты, мевалонил-5-фосфата и мевалонил-5-пирофосфата в полипреноиды хлоропластов шпината и хромопластов желтого нарцисса.
На основании полученных результатов K.Kreuz, H.Kleinig заключили, что непосредственный предшественник синтеза каротиноидов - изопентенилпирофосфат - синтезируется в цитоплазме растительных клеток, после чего поступает в строму пластид, где он используется при образовании указанных полипреноидов.
Выводы, сделанные K.Kreuz, H.Kleinig, не подтвердились результатами, свидетельствующими, что хромопласты плодов перца однолетнего способны осуществлять все реакции, ведущие к образованию каротиноидов из первичных предшественников. B.Camara и сотр. выявили автономность хромопластов в биосинтезе каротиноидов.
