Выделение чистых препаратов хромопластов
Хромопласты имеют ряд особенностей, которые не позволяют использовать при их выделении методы, разработанные для хлоропластов. Они содержат много липофильных соединений (липиды, пренилхиноны, каротиноиды), приводящих к уменьшению их плавучей плотности и способствующих агглютинации их между собой или с другими липофильными структурами разрушенных клеток.
Выделение таких хромопластов проводят в высокоскоростных центрифугах, в специальных условиях для устранения агглютинации.
Однако это создает дополнительные трудности при получении интактных органелл, поскольку крахмальные гранулы при центрифугировании способны под действием центробежных сил разрывать мембраны оболочки, нарушая интактность органелл. Поэтому для выделения крахмалсодержащих органелл неприемлемы методы, в которых используется ультраскоростное центрифугирование.
Особенно трудно очистить кристаллические хромопласты, которые состоят из каротгагоидного кристалла с незначительным количеством стромы. Мембраны, вокруг кристаллических хромопластов очень хрупки и разрываются при самых незначительных повышениях напряжения.
Первое описание выделения чистых хромопластов представлено W.Straus, изучавшим пластиды корнеплодов моркови. Очищенные корнеплоды предварительно охлаждали и измельчали в специальном устройстве с помощью вращающихся ножей, морковный сок отфильтровывали через нейлоновую ткань.
Все последующие операции проводили на холоде. Морковный сок после этого центрифугировали 30 мин при 1100 об/мин (150 g) и осадок отбрасывали. Супернатант центрифугировали 30 мин при И 000 об/мин (20 000 g) в 50 мл пробирках на угловом роторе. Слой, плавающий на поверхности, использовался для дальнейшей очистки органелл, именуемых авторами красными хромопластами, а осадок - для получения чистой фракции оранжевых хромопластов.
Для очистки красных хромопластов плавающий на поверхности суспензии слой, состоящий из хромопластов и загрязняющих структур, адсорбировали на полоске фильтровальной бумаги (Ватман №1) к фильтровальную бумагу сразу же опускали в 140 мл холодной дистиллированной воды.
Хромопласты ресуспендировались, после чего водная суспензия центрифугировалась 30 мин при 20 000 g в угловом роторе. Пробирки быстро переворачивались и маслянистый материал, прилипший к боковым стенкам, осторожно смывали, не повреждая осадок красных хромопластов.
Если микроскопическое исследование ресуспендированных хромопластов обнаруживало в них какие-либо примеси, высокоскоростное центрифугирование водной суспензии повторяли. Для выделения оранжевых хромопластов использовали осадок, полученный после 30 мин центрифугирования при 20 000 g супернатантной жидкости.
После декантации маслянистый материал, прилипший к стенкам пробирки, смывали дистиллированной водой, не нарушая осадка. Затем осадок суспендировали в 30 %-ном растворе сахарозы, доведенном до рН 8,0 с помощью КОН и суспензию центрифугировали 15 мин при 3800 об/мин (2000 g) в угловом роторе в 50 мл пробирках.
Слой, плавающий на поверхности суспензии, отбрасывался. Суспензия декантировалась и центрифугирование в течение 15 мин при 3800 об/мин повторялось, а слой, плавающий на поверхности, удалялся. Затем сахарозную суспензию центрифугировали в течение 45 мин при 11 000 об/мин (15 000 g) в угловом роторе.
Оранжевые слои, которые плавали на поверхности суспензии и прилипали к стенкам 50 мл пробирок над поверхностью суспензии, адсорбировали на небольшом кусочке ваты и ресуспендировали в 15 мл воды, надавливая на вату шпателем. Хромопласты, которые прилипали к стенке ниже поверхности жидкости, очищались следующим образом.
Суспензия декантировалась на противоположную (центрифужную) сторону пробирки. Осадок на дне пробирки полностью удалялся малыми порциями дистиллированной воды. Хромопласты ресуспендировались в дистиллированной воде с помощью стеклянной палочки. Хромопластная суспензия в дистиллированной воде центрифугировалась 10 мин при 150 об/мин (260 g) и осадок отбрасывался.
Суспензия разбавлялась дистиллированной водой до 75 мл и центрифугировалась при 11 000 об/мин 30 мин. Осадок ресуспендировался и если в нем в результате микроскопических исследований обнаруживались примеси, окрашиваемые метиленовым голубым, дифференциальная седиментация повторялась.
Выход красных хромопластов составлял 5-10 мг, оранжевых - 5 мг на 600 мл морковного сока. Очищенные фракции хромопластов моркови W.Straus использовал в изучении биохимического состава и ферментных активностей.
Метод выделения чистой фракции хромопластов из корнеплодов моркови
Однако в условиях наших экспериментов более приемлемым оказался следующий метод выделения чистой фракции хромопластов из корнеплодов моркови. Ткань корнеплода измельчали с помощью пластмассовой терки и заливали в соотношении 1:3 средой выделения 0,05 М трис, 0,5 М маинит, 0,03 М аскорбиновой кислоты, 0,01 М ЭДТА, 0,1 %-ный бычий сывороточный альбумин (рН среды 7,8 - 7,9).
Гомогенат отжимали через четыре слоя хлопчатобумажной ткани, фильтровали через 10 слоев та кой же ткани и вновь фильтровали через 6 слоев нейлоновой ткани для отделения клеточных фрагментов. Фильтрат отстаивали 1 ч, после чего Проводили декантацию. Полученную жидкую фазу центрифугировали 10 мин при 500 об/мин на центрифуге ЦЛР-1.
Осадок крахмальных зерен отбрасывали, а надосадочную жидкость центрифугировали при 2000 об/мин 20 мин. Полученный осадок содержал, помимо хромопластов, амилопласты. Для отделения хромопластов использовали центрифугирование суспензии пластид при наслаивании ее на слой 50 %-ной сахарозы 30 мин при 14 000 g.
Амилопласты осаждались на дно центрифужной пробирки, а хромопласты образовывали слой над 50 %-ной сахарозой. Хромопласты отбирали, разбавляли промывочной средой (0,05 М трис, 0,3 М маннит, 0,2 М сахароза, 0,01 М ЭДТА, 0,1 %-ный бычий сывороточный альбумин, 0,03 М аскорбиновая кислота; рН 7,5) и осаждали центрифугированием.
Полученные препараты хромопластов содержали меньше 1 % непластидных примесей, среди которых отсутствовали ядра, их фрагменты и 5 % амилопластов. Полученные описанным методом фракции хромопластов содержали в среднем около 15 % крахмала, что позволяло нам выделять эти органеллы практически без использования высокоскоростных центрифуг. Лишь на одном этапе очистки использовалось центрифугирование при 14 000 g.
Однако следует отметить низкий выход хромопластов, а применение разработанного нами метода было успешным только при выделении пластид из корнеплодов, отобранных во время вегетации. Из хранящихся корнеплодов нам не удавалось очистить хромопласты, по-видимому, из-за роста выкристаллизованного пигмента и потери крахмала.
Используемая нами среда для выделения в качестве осмотического реагента содержала маннит и в ней отсутствовали ионы двухвалентных металлов, способствующих агглютинации хромопластов между собой и с другими липофильными загрязнениями. С этой же целью в среду вводили 0,01 М ЭДТА. Бычий сывороточный альбумин и аскорбиновая кислота использовались для подавления окислительных процессов.
При выделении очищенных препаратов из лепестков нарцисса желтого успешно использовались два подхода. Один из них основан на использовании высокоскоростного центрифугирования. Ткань венца нарезали небольшими кусочками в малом количестве охлажденной среды, содержащей 0,47 М сахарозы, 5 мМ MgCl, 0,2 % поливинилпирролидона, мол. вес 360 000, 0,067 М фосфатного буфера, рН 7,5.
Смесь доводили до соотношения ткань : среда = 1 : 3 и гомогенизировали. Гомогенат фильтровали через 4 слоя нейлоновой ткани и клеточные обрывки удаляли низкоскоростным центрифугированием (15 мин, 1000g 4°С). Хромопласты седиментировали из супернатанта в пробирках 8-36 мл углового ротора при 16 500 g 20 мин.
Осадок осторожно ресуспендировали в поттеровском гомогенизаторе 0,067 М фосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 50 % сахарозы и 5 мМ MgCl2, переносили в центрифужные пробирки и наслаивали на суспензию равные объемы 40-, 30- и 15 %-ной сахарозы, приготовленной на том же буфере. Ступенчатый градиент затем центрифугировали 1 ч в 3*34 мл пробирках в бакет-роторе при 50 000g.
Хромопласты, которые образовывали полосы в интерфазах между слоями 40- и 30 %-ной, а также между слоями 30- и 15 %-ной сахарозы, осторожно удаляли с помощью пастеровской пипетки. Эти фракции разбавляли 5 мл MgCl3 (5 мМ) 0,067 М фосфатным буфером, рН 7,5, до конечной концентрации 15 %-ной сахарозы. Хромопластный осадок получали центрифугированием 20 мин в 8'38 мл угловом роторе при 16 500g.
Все этапы выделения проводились при 4°С . Как можно отметить, в данной методике среда для выделения хромопластов из венцов нарцисса содержала ионы магния, в качестве осмотического агента - сахарозу, антиокислителя - поливинилпирролидон, в дальнейшем условия выделения органелл несколько модифицировались
В среде для выделения хромопластов сахароза была заменена 0,33 М сорбитом, фосфатный буфер - 50 мМ трицин/КОН, рН 8,0 буфером, хлористый магний удалялся и вместо него использовали хелатирующий агент - 3 мМ ЭДТА, в качестве антиокислителя вместе с 0,2 % поливинилпирролидоном использовали 1 мМ меркаптоэтанол.
Хромопластные полосы (при 40/30 и 30/15 %-ных интерфазах сахарозного градиента) смешивали с буфером I (0,33 М сорбит, 50 мМ трицин/КОН, рН 8,0, 3 мМ ЭДТА) в соотношении 1:1 и осаждали при 17 000g 20 мин. Для дальнейшей очистки осадок суспендировали в буфере I и наслаивали на ступенчатый градиент плотности перколла (5, 25 и 50 %, каждый в растворе 0,28 М сахарозы, 50 мМ трицин/КОН рН 8,0 и 3 мМ ЭДТА).
После центрифугирования в угловом роторе (30 мин при 11 000 g) хромопластная полоса отбиралась из 5-25 %-ной интерфазы градиента перколла, разбавлялась 1:1 буфером I и осаждалась 20 мин при 12 000 g. Затем органеллы еще раз промывались в буфере I. Альтернативный способ выделения хромопластов из венца нарцисса желтого включал гель-фильтрацию на сефадексе Г-50 марки "грубый".
Использование флотации пластид в ступенчатых градиентах и гель-фильтрации позволяло получать достаточно чистые препараты органелл. Однако недостатком последнего метода были продолжительность и очень низкий выход хромопластов. Поэтому в большинстве исследований использовали при выделении хромопластов флотацию в ступенчатых градиентах.
При изучении биохимических характеристик хромопластов перца ткань перикарпа плодов измельчали с помощью терки и инфильтровали в среде для выделения при 4°С. Среда для выделения содержала 1 мМ 0-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, 0,4 М сахарозы, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0. Материал гомогенизировался в блендере и фильтровался через 4 слоя ткани с сеткой 50 мкм.
Клеточные обрывки удалялись центрифугированием 5 мин при 150 g на холоде. Грубую хромопластную фракцию осаждали 10 мин центрифугированием супернатанта при 2000 g. 2 мл грубой хромопластной суспензии наслаивали на ступенчатый градиент, состоящий из 0,46 М, 0,84 Ми 1,45 М сахарозы, забуференной 1 мМ 0-меркаптоэтанолом и 50 мМ трис-HCl, рН 7,0 (объем каждой концентрации сахарозы 9 мл).
Градиент центрифугировали 1 ч при 62 000g. Хромопласты образовывали полосы в интерфазах между 0,46 М и 0,84 М, а также между 0,84 М и 1,45 М сахарозы в ступенчатом градиенте. Исследования показали, что полоса 0,46/0,84 М сахарозы содержит разрушенные хромопласты. Поэтому отбиралась только полоса, расположенная в интерфазе между 0,84 М и 1,45 М сахарозы.
Она использовалась непосредственно в исследовании биохимических характеристик или после разбавления (1 мл хромопластной суспензии + 1 мл 50 мМ трис-НО, рН 7,0) с последующим центрифугированием при 4000 g 5 мин.
Авторы показали, что добавление в среду для выделения, а также в ступенчатый градиент хлористого магния способствует агглютинации на хромопластах значительных количеств различных примесей. Это существенно влияло на результаты определения некоторых биохимических показателей, в частности на состав липидных компонентов.
Описан способ выделения интактных хромопластов из плодов томатов, находящихся на разных этапах созревания. Метод включает два принципиально важных момента: гель-фильтрацию на колонке с сефадексом Г-25 ("грубый") гомогената ткани и центрифугирование в градиенте плотности перколла. Пропускание гомогената ткани через сефадекс предотвращает желирование гомогената.
40 г перикарпа томатов погружали в раствор (40 мл), содержащий 0,1 М трицин/КОН, рН 8,0, 0,33 М сорбит, и нарезали лезвием на кусочки. Затем смесь осторожно гомогенизировали в ступке с последующей фильтрацией через мираклос. Фильтрат пропускали через сефадекс Г-25 ("грубый") на 50 мл колонке, предварительно уравновешенной 0,05 М трицин/КОН, рН 8,0, 0,33 М сорбит.
20 мл фракции свободного объема отбирали и наносили по 10 мл на 50 мл линейного градиента плотности перколла (11-88 %) и центрифугировали при 7000 об/мин 20 мин. Градиент перколла содержал 0,05 М трицин КОН, рН 8,0, 0,33 М сорбит, 5 % полиэтиленгликоль 6000 и 1 % фиколл 400.
После центрифугирования градиент раскапывался на 1,5 мл фракции. Пиковые (по окраске) фракции собирали, разбавляли в 2 раза 0,05 М трицин /КОН, рН 8,0, 0,33 М сорбит, после чего пластиды осаждали 2 мин при 2000 g и использовали для анализа.
Используя этот метод, авторы смогли очистить даже кристаллические хромопласты зрелых плодов, содержащие в основном длинные кристалловидные формы ликопина, разрушаемые при осаждении. Поэтому для изучения биохимических характеристик кристаллических хромопластов томатов рекомендуется использовать фракции, полученные после раскапывания градиента перколла без последующего разбавления и осаждения.
Хромопласты из различных источников существенно различаются между собой по структуре, биохимическому составу и другим свойствам. Поэтому трудно разработать универсальный метод, позволяющий получать чистые препараты интактных хромопластов из любого источника. Используемый метод выделения очищенной фракции хромопластов нарцисса желтого не давал положительных результатов при работе с цветками розы, одуванчик it и других растений.
В опытах с новыми объектами следует разрабатывать методы выделения, учитывая некоторые основные принципы:
- не применять в средах солей двухвалентных металлов;
- в качестве осмотических агентов лучше использовать "мягкие" агенты, такие, как сорбит или маннит, вместо сахарозы;
- среда для выделения должна содержать антиокислители, такие, как (3-меркаптоэтанол, дитиотреитол, поливинилпирролидон, аскорбиновая кислота, бычий сывороточный альбумин или какой-нибудь другой;
- выделение проводить при 0 +4 °С.