Фракционный состав РНК
Неодинаковая интенсивность включения меченого предшественника в РНК хромо- и амилопластов корнеплодов моркови свидетельствовала о существенных изменениях в функционировании пластид в зависимости от специализации в накоплении запасных веществ.
В связи с этим представляют интерес результаты фракционирования суммарных РНК изучаемых пластид корнеплодов белой и красной моркови.
Электрофоретическое разделение немеченой РНК
Известно, что основными фракциями хлоропластных РНК, обнаруживаемых при электрофорезе в полиакриламидном геле, являются рибосомные 23 S и 16S РНК, а также 4-5S РНК, состоящая из транспортных и низкомолекулярных рибосомных РНК. Кроме того, иногда исследователям удавалось обнаружить РНК, мигрирующую в ПААГ несколько быстрее 16S РНК.
По-видимому, эта РНК соответствует мРНК быстрообращающегося тилакоидного белка с молекулярной массой 32 000 дальтон. В отличие от хлоропластов высших растений и водорослей амилопласты клубней картофеля не содержат рибосомных РНК.
Суммарная амилопластная РНК клубней картофеля представлена гомогенным пиком низкомолекулярной РЖ, коэффициент седиментации которой 4,2S.
Для фракционирования суммарных препаратов РНК чаще всего применяется электрофорез в гелях с низкими концентрациями полиакриламида (2,0-3,0 %). Такие гели имеют студенистую консистенцию и легко разрываются при манипуляциях с ними.
Поэтому для улучшения механических характеристик таких гелей и для облегчения анализа рибонуклеиновых кислот мы использовали смешанные агароза-полиакриламидные гели с концентрацией агарозы 0,5 %. Агароза в концентрациях 0,2-0,5 % образует сетку с порами, не препятствующими продвижению рибонуклеиновых кислот.
Таким образом, в смешанных агароза-полиакриламидных гелях разделение РНК происходит только за счет трения молекул со стенками решетки, образованной акриламидом и метилен-бис-акриламидом. При этом агароза обеспечивает плотность и жесткость гелей, делая их удобными для исследований.
Поскольку 23S РНК пластид растений характеризуется нестабильностью в отсутствии двухвалентных катионов, выделение РНК амило- и хромопластов корнеплодов белой и красной моркови и анализ их методом электрофо реза проводили в присутствии хлористого магния.
Результаты исследования фракционного состава РНК хромопластов формирующихся корнеплодов моркови сорта Харьковская Нантская свидетельствуют о наличии в них молекул, мигрирующих при электрофорезе в области 23S и 16S рибосомных РНК, а также в районе 4-5S РНК. Сходные картины распределения наблюдались также при исследовании РНК хромопластов, выделенных из корнеплодов в середине и в конце вегетационного периода (рис. 1).
Амилопласты формирующихся корнеплодов моркови сорта Белая зеленоголовая также содержали 23S, 16S и 4-5S РНК.
Однако в амилопластах, выделенных из корнеплодов белой моркови в середине и в конце вегетации, рибосомные 23S и 16S РНК отсутствовали и суммарная амилопластная РНК была представлена низкомолекулярной фракцией, сходной по электро-форетической подвижности с 4.2S РНК амилопластов запасающих тканей клубней картофеля.
Для выяснения возможности деградации высокомолекулярных рибосомных РНК в процессе ее выделения были проведены дополнительные исследования по изучению РНКазной активности хромо-и амилопластов. При выделении амило- и хромопластов моркови мы использовали додецилсульфат натрия. Известно, что этот детергент ингибирует нуклеазы, в том числе и РНКазы.
Кроме того, в лизирующую среду мы вносили поливинил-сульфат, который также является ингибитором РНКазной активности. Определение РНКазной активности пластид запасающих тканей корнеплодов белой и красной моркови проводилось в средах для выделения РНК в отсутствие и в присутствии указанных ингибиторов.
В основу определения РНКазной активности была положена пропись B.Srivastava И G.Ware, в которую были внесены некоторые изменения, связанные со специфичностью исследуемых объектов. Количество пластид в пробах и кратность разбавления проб подбирали с таким расчетом, что оптическое поглощение конечного раствора находилось в пределах 0,4-0,6 при исследовании хромопластов до формирующихся корнеплодов (диаметр 3-5 мм).
Результаты исследований показали, что амилопласты обладают более низкой РНКазной активностью по сравнению с хромопластами. Более того, РНКазная активность изолированных амилопластов заметно снижалась к концу вегетационного периода, тогда как ее величина в хромопластах существенно не изменялась в онтогенезе корнеплодов растений красной моркови.
Добавление в среду додецилсульфата натрия заметно подавляло РНКазную активность в обоих типах пластид, однако при этом она еще сохранялась на довольно высоком уровне (22-35 ед. активности на 4*109
пластид для амилопластов и. 108-120 - для хромопластов).
Одновременное добавление додецилсульфата натрия и поливинил-сульфата, как нами обычно делалось в соответствии с методикой выделения РНК, полностью ингибировало РНКазную активность в обоих типах пластид.
Следует отметить, что используемый метод определения РНКазной активности по оптическому поглощению надосадочной жидкости, предложенный B.Srivastava и G.Ware, не совершенен, поскольку не исключает возможности выпадения в осадок части фрагментов РНК. Поэтому наличие РНКазной активности определяли дополнительно по гиперхромному эффекту осажденной РНК.
Г.Д.Кречетова и соавт. показали чувствительность этого метода. Его использование позволяет обнаружить наличие РНКазной активности даже тогда, когда она не выявлялась измерением поглощения надосадочной жидкости. Исследования показали, что выпавшая в осадок РНК, обработанная ферментным препаратом из пластид, не содержащим ингибиторов нуклеазной активности, имеет низкий гиперхромный эффект.
В то же время РНК, обработанная ферментным препаратом, содержащим додецилсульфат натрия, сохраняла около 80 % гиперхромизма, а РНК, обработанная ферментным препаратом, содержащим додецилсульфат натрия совместно с поливинил-сульфатом, по гиперхромному эффекту не отличались от контроля.
Результаты исследования РНКазной активности по оптическому поглощению надосадочной жидкости и гиперхромному эффекту осажденной РНК показали, что введение в среду для выделения РНК додецилсульфата натрия и поливинил-сульфата полностью подавляет РНКазную активность.
Следовательно, низкомолекулярная РНК в амилопластах корнеплодов белой моркови не является продуктом деградации высокомолекулярных рибосомных РНК в процессе ее выделения.
Кроме того, наши результаты указывают на отсутствие среди преобладающих компонентов хромопластной РНК молекул, других, чем 23 S, 16S и 4-5 S РНК. Таким образом, исследования показали, что хромопласты корнеплодов красной моркови, как и хлоропласты листьев высших растении и водорослей содержат рибосомные РНК. В то же время амилопласты корнеплодов белой моркови в процессе вегетации теряют рибосомные РНК.
При этом в них обнаружена низкомолекулярная РНК, сходная по электрофоретической подвижности с 4,2S РНК, выявленной в амилопластах клубней картофеля.