Выделение хромопластной ДНК

Для изучения физико-химических характеристик используется высокоочищенная ДНК. Однако вещества вторичного происхождения (фенольные соединения, полисахариды и др.) активные нуклеазы затрудняют ее выделение. Следует также иметь в виду, что методы выделения чистых препаратов ДНК, применяемые для одного объекта, для других не дают положительных результатов.

Это подтвердилось нашими опытами по очистке ДНК из пластид корнеплодов и листьев моркови. Использование различных модификаций фенол-хлороформ-детергентного метода, фракционирование на колонках с оксиапатитом, а также применение цетавлона не давало положительных результатов.

Полученные при этом препараты ДНК не отвечали требованиям, предъявляемым к чистым нативным ДНК. Отмечалось загрязнение белками и полисахаридами и низкий гиперхромный эффект ДНК (табл. 1).

Чистота и нативность препаратов улучшались при комбинировании определенных этапов различных методов. Использование фенол-хлороформ-детергентной депротеинизации, с хроматографией на оксиапатите позволило нам получать препараты пластидных ДНК, хорошо очищенных от белков (А₂₆₀/А₂₃₀ = 1,8-1,85) и полисахаридов (А₂₆₀/А₂₃₀ = 1,95-2,05) и обладающих высоким уровнем нативности (гиперхромный эффект находился в пределах 33-38 %) независимо от вида исследуемых растений.

Таблица 1. Характеристика препаратов ДНК хромопластов корнеплодов красной моркови сорта Харьковская Нантская, выделенных при использовании различных методик

Важным моментом при получении очищенных препаратов пластидных ДНК является устранение примесей ядерных ДНК. В среднем в одном ядре содержится столько же ДНК, сколько ее имеется в тысяче пластид. Следовательно, даже незаметные загрязнения препаратов хлоро-, хромопластов или других пластид ядерными фрагментами может влиять на результаты изучения физико-химических характеристик пластидных ДНК.

С целью устранения возможных примесей ядерных ДНК используется инкубация пластид в присутствии нуклеаз. R.Herrmann с соавт. показал, что сочетание обработок ДНКазой и фосфодиэстеразой полностью устраняет примеси ядерной ДНК в препаратах пластид практически из любого растения. Смысл нуклеазной обработки заключается в том, что ДНКаза и фосфоди-эстераза легко проникают через интактную ядерную оболочку, но внутрь интактных пластид не проникают.

При нуклеазной обработке разрушаются все ядерные ДНК, а также ДНК органелл с поврежденными мембранами оболочки, в то время как ДНК интактных пластид остается в нативном состоянии. Имеется еще один путь избавления от ядерных примесей. H.Bohnert, E.Crouse, изучая условия для получения очищенных препаратов хлоропластной ДНК, установили, что многократное промывание пластид в буфере, содержащем ЭДТА, также эффективно в удалении ядер и их фрагментов.

При получении препаратов ДНК из пластид корнеплодов и листьев моркови В. П. Лобов и И. А. Петров использовали как нуклеазную обработку, так и промывание органелл в среде, содержащей ЭДТА. Надежным критерием чистоты пластидных ДНК является их способность к быстрой ренатурации.

Пластидные ДНК, характеризующиеся незначительной по сравнению с ядерной ДНК кинетической сложностью, быстро реассоциируют после денатурации, тогда как денатурированная ядерная ДНК реассоциирует продолжительное время. Полученные В. П. Лобовым и И. А. Петровым препараты пластидных ДНК моркови через 120 мин реассоциировали до исходного поглощения при длине волны 260 нм (рис. 1).

Это свидетельствовало об отсутствии ядерных загрязнений в препаратах пластидных ДНК, что позволило использовать их в изучении тепловой денатурации и кинетики ре-ассоциации. Рисунок 1 - Восстановление нативности нефрагментированиой денатурированной ДНК: хлоропластов (а) и хромопластов (б) моркови сорта Харьковская Нантская (1); хромопластов моркови сорта Мшак (2); амилопластов моркови сорта Белая зелено-головая (3). Пунктиром обозначена тепловая денатурация ДНК до температуры 98 С; сплошная линия - ренатурация ДНК при 60 ° С.

Последовательные этапы разработанного В. П. Лобовым и И. А. Петровым метода выделения ДНК из хромопластов корнеплодов красной моркови сорта Харьковская Нантская, а также хромопластов желтой моркови сорта Мшак, амилопластов белой моркови сорта Белая зеленоголовая и хлоропластов листьев указанных сортов моркови, описаны ниже.

Фракцию изолированных пластид суспендировали в среде для выделения (0,05 М трис, 0,5 М маннит, 0,03 М аскорбино вая кислота, 0,01 М ЭДТА; 0,1 %-ный бычий сывороточный альбумин, рН среды 7,8-7,9), содержащей 10 мМ хлористого магния, добавляли ДНКазу из расчета 100 мкг/мл и инкубировали 30 мин при 0 - +4 °С, постоянно перемешивая суспензию.

Затем добавляли фосфодиэстеразу змеиного яда га расчета 30 мкг/мл и инкубацию продолжали еще 20 мин. Для прекращения действия нуклеаз добавляли трехкратный объем раствора щелочного ЭДТА (0,15 М NaOH, 01 М ЭДТА, рН 8,0) и обработанные таким образом пластиды осаждали центрифугированием 30 мин при 2500 об/мин. Осадок пластид лизировали в 10-кратном объеме щелочного ЭДТА, содержащем 3 % додецилсульфата натрия.

Лизат экстрагировали равными объемами водонасыщенного фенола, рН 8,0, смесью фенол:хлороформ (4:1), а также эфиром - дважды в каждом случае. Затем нижнюю фазу диализовали в течение ночи против 0,24 М натрий-фосфатного буфера рН 6,8, обрабатывали 4 ч проназой (50 мкг/мл), доводили до 8 М мочевиной и 1 М NaCl и очищали на колонке с оксиапатитом. Для этого полученный раствор ДНК пропускали через колонку с оксиапатитом, предварительно уравновешенным раствором, содержащим 0,18 М натрий-фосфатного буфера, 1 М NaCl и 8 М мочевины.

Этим же раствором промывали колонку до исключения поглощения эллюента при 260 нм. В процессе указанных процедур ДНК адсорбируется на оксиапатите, тогда как загрязняющие вещества не задерживаются на колонке. Затем колонку промывали 0,10 М натрий-фосфатным буфером с целью удаления мочевины и ДНК смывали 0,4 М натрий-фосфатным буфером. R.Herrmann применял при выделении ДНК из органелл нарцисса желтого следующие процедуры.

Органеллы суспендировались в 2 объемах 0,3 М NaCl 0,03 М трис, рН 8,7 (или 0,3 М NaCl, 0,03 М цитрат натрия, рН 8,0) и лизировались 10 мин при комнатной температуре додецилсульфатом натрия (5 %). Смесь осторожно встряхивали с равным объемом хлороформа с октанолом (6:1) и центрифугировали 15 мин при 8000 g. Водный слой и интерфазу объединяли, осторожно перемешивали с фенолом, насыщенным 0,03 М трис, рН 8,7, содержащим 5 капель 32%-ного NaOH на 100 мл фенола и центрифугировали 20 мин при 10 000 g.

Фенольную обработку и центрифугирование повторяли. Водная фаза и интерфаза дважды экстрагировалась эфиром и диализовалась при 2 °С против 0,4- (0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия, рН 8,0) в течение ночи. Затем растворы обрабатывались 40 мкг/мл свободной от ДНКазы РНКазой А и 200 единиц/мл РНКазы _T1 90 мин при 37 °С.

После этого проводили обработку свободной от ДНКазы проназой с добавлением 0,15 % додецилсульфата натрия 4 ч при 40 °С. Ферменты удаляли фенольной депрогеинизацией, а водную фазу диализовали против соответствующего буфера и подвергали дальнейшей очистке в градиенте плотности хлористого цезия. Для этого доводили раствор ДНК до плотности 1,710 г/см3.

Центрифугирование проводили в 5 мл пробирках в бакет-роторе при 33 000 об/мин 68 ч при 20 °С. Градиент раскапывали, ДНК-содержащие фракции собирали, диализовали против 0,3* (0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия) и использовали для изучения физико-химических свойств. Выделение хромопластной ДНК нарцисса желтого

При выделении кольцевых молекул из хромопластов нарцисса желтого и тюльпана использовался метод, примененный ранее для идентификации кольцевых молекул в хлоропластах шпината. К 2 мл суспензии очищенных пластид добавляли 2 мл раствора, содержащего 0,79 М сахарозы, 0,15. М NaCl, 0,1 М ЭДТА, SO мМ трис-HCl, рН 9,0, а также доде-цилсульфат натрия (до конечной концентрации 0,5%)., проназу (1 мг/мл) и дезоксихолат натрия (1 %).

При инкубации смесь перемешивали при 4 °С с последующим постоянным добавлением пяти-молярного перхлората натрия до конечной концентрации 1 М и выдерживали 30 мин при 4 °С с 0,5 объема хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) и 1 объемом фенола насыщенного 0,15 М NaCl, 0,1 М ЭДТА, 50 мМ трис, рН 9,0. Смесь центрифугировали при 1000g 15 мин при 4 °С.

Водная фаза удалялась и диализовалась в течение ночи против 0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия, 0,5 мМ ЭДТА, рН 8,0, на холоду. После этих операций ДНК была готова для электронно-микроскопических исследований. Существенным моментом в описанной методике является использование проназы, которая разрушает белки, освобождая интактные молекулы ДНК.

Однако это возможно только в случае отсутствия примесей ДИКазы в препаратах фермента. J J.Thompson , изучая физико-химические характеристики ДНКаз, для выделения хромопластов настурции большой использовал метод R.Ko-lodner, K.Tewari , разработанный для хлоропластов высших растений.

Согласно этой методике пластидная фракция после обработки ДНКазой и промывки ЭДТА осаждалась, затем ресуспендировалась в 4,8 мл буфера А, содержащего 0,05 М трис, 0,002 М ЭДТА, рН 8,0, проназу (200 мкг/мл).

К суспензии добавляли 1,2 мл 10 %-ного саркозила натрия в том же растворе и смесь инкубировали 30 мин при 37 °С в стеклянной центрифужной пробирке. Затем добавляли 2 мл буфера А, содержащего 4 М хлористого цезия, и пробирки помещали на лед в течение 90 мин.

Смесь центрифугировали 30 мин при 1200 g на холоду (4 °С) и супернатант переносили в нитроцеллюлозные пробирки, которые предварительно вымачивали в течение ночи в 10 %-ном саркозиле натрия. В каждую центрифужную пробирку добавляли 3,2 г хлористого цезия и 0,2 мл раствора бромистого этидия (10 мкг/мл).

Каждая пробирка подслаивалась 3 мл подушкой, содержащей хлористый цезий (р =1,74), 0,05 М трис, 0,01 М ЭДТА, 200 мкг/мл бромистого этидия, рН 8,0, и пробирки центрифугировались 12-16 ч в Spinco SW = т 41 роторе при 25 000 об/мин. После остановки центрифуги пробирки исследовались под длинноволновым ультрафиолетовым светом β65 нм) и флуоресцирующие полосы ДНК отбирались.

Пластидные ДНК с шести градиентов объединялись и помещались в обработанных саркозилом натрия нитроцеллюлоэных пробирках^Затем растворы ДНК разбавляли 5 мл раствора, содержащего хлористый цезий (р = 1,57), 0,05 М трис, 0,01 М ЭДТА, 200 мкг/мл бромистого этидия, рН 8,0; и ДНК повторно центрифугировалась 30-48 ч в Spinco SW = 41 роторе при 32 000 об/мин.

Этидий бромистый из ДНК-содержащей фракции градиента удалялся экстракцией изопентиловым спиртом, насыщенным 0,01 М ЭДТА, а ДНК диализовалось против трех смен 0,1 М NaCl 0,05 М трис, 0,01 М ЭДТА, рН 8,0 (500 мл). Использование этого метода для выделения ДНК из хромопластов лепестков настурции большой позволило J.Thompson получить препараты, состоящие из 52 % кольцевых и 48 % линейных молекул.

В целом выбор метода выделения ДНК зависит от цели эксперимента. При изучении тепловой денатурации и кинетики ре-ассоциации, например, где необходимы высокая степень чистоты, но используется фрагментированная ДНК, лучше использовать методы, не требующие ультрацентрифугирования.

При выделении ДНК для электронно-микроскопических исследований и рестрикционного анализа чаще используют центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия и мягкие условия лизиса органелл во избежание фрагментации ДНК под действием механических факторов.

Продолжение: Размер и конформация ДНК.